Práctica 2-Shouthern blot

OBJETIVO:

-Desarrollar el conocimiento de las técnicas de hibridación.

MATERIALES:

• Aparato de electroforesis horizontal 
• Fuente de energía para la electroforesis. 
• Sistema de visualización del ADN 
• Bandeja para la tinción.
• Baño de agua.
• Estufa o incubador 80ºC (OPCIONAL).
• Micropipetas automáticas y puntas. 
• Microtubos y tubos de 10 ml. 
• Placa calefactora o microondas.
• Agua destilada 
• NaCl. 
• NaOH 
• HCl concentrado.
• Plástico para envolver y papel secante.

PRÁCTICA:

Primero preparamos el gel  de agarosa al 0.8% para la electroforesis de las muestras lista para ser sembradas.Utilizamos un gel de 7 x 7 cm o 7 x 10 cm. Con 6 pocillos con una capacidad de 40 ul. 

Antes de la siembra de las muestras en un baño de agua a 65ºC para calentamos las muestras que contiene el ADN  durante 2 minutos y dejamos enfriar las muestras otros 2 minutos.

Posteriormente sembramos las muestras A-E en pocillos consecutivos. La cantidad de muestra a siembra debe ser de 35-58 ul.

Corremos el gel después de la siembra, configuramos la fuente de electroforesis al voltaje requerido. Una vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot. (La electroforesis debería pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado aproximadamente 4.5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.)

Una vez hecho esto podemos llevar a cabo el análisis de southern blot, durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon. Después de la trasferencia, la membrana será incubada durante un periodo corto de tiempo para fijar el ADN a la membrana (para evitar reactivos tóxicos y especialmente radioactivos)

Despurinizamos y desnaturalizamos después de la electroforesis, el gel es secuencialmente tratado con HCl y NaoH. 

• El HCl introduce sitios apurínicos en el ADN lo cual produce uniones fosfodiester e introduce “nicks” en el ADN de doble cadena. 
• El tratamiento con NaOH rompe los puentes de hidrógeno entre las bases. El secuencial tratamiento ácido/base resulta en la formación de pequeños fragmentos que facilita la trasferencia de los fragmentos de ADN en la membrana de nylon. 

Después de la electroforesis colocamos el gel de agarosa en una cubeta con 100 ml de 0.25 N HCl. 

Incubamos a temperatura ambiente durante 8 minutos. El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente. Eliminamos con cuidado la solución que no se podrá reutilizar y lavamos el gel con diversos cambios de 100 ml de agua destilada. 

Colocamos el gel durante 15 minutos en la solución de Desnaturalización del ADN (0.5 M NaOH/0.6 M NaCl). El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitamos periódicamente a continuación eliminar la solución. 

Utilizamos otros 100 ml de Solución de desnaturalización e incubamos otros 15 minutos. Conservamos está solución para después. 

Configuramos la transferencia del Southern Blot colocando unas hojas de papel de plástico, de aluminio o papel whatman en una superficie plana del laboratorio. Sacamos el gel e invirtiendo el gel (los pocillos hacia abajo) colocamos la superficie lisa de forma que quedará en contacto con la membrana de transferencia.

Utilizando siempre guantes, con pinzas y tijeras ajustamos la membrana de nylon al tamaño del gel.

Recogemos con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y ligeramente doblada en el centro y lentamente humedecemos (desde la mitad hacia afuera) con la solución de desnaturalización del punto anterior liberamos la membrana y sumergimos suavemente durante 5 minutos en la solución de desnaturalizción. Sacamos la membrana saturada de la Solución de desnaturalización y la colocamos encima del gel de agarosa asegurandonos de que no queden burbujas de aire.

Recortamos el papel de filtro de blotting del mismo tamaño del gel y la membrana de nylon y lo colocamos en el papel de filtro encima de la membrana. Cuidadosamente colocamos un montón de papel absorbente encima del filtro de blotting, una bandeja o placa de cristal y unos circulos que hagan de peso.  

Dejamos que la transferencia progrese hasta el siguiente día eliminamos la placa de vidrio, peso y papeles absorbentes y con guantes enjuagados y pinzas voltear el conjunto (gel-nylon-papel de filtro) de forma que descanse sobre el papel de filtro.

Utilizando un rotulador dibujamos los 6 pocillos de muestra y rastrear sus posiciones en la membrana de nylon, retiramos el gel de la membrana. Ponemos la membrana encima de un montón de papel seco con el AD hacía arriba (el lado que estuvo en contacto con el gel).

Por último, marcamos la membrana por el lado del ADN con el nº de grupo o nombre 16y secamos y fijamos el ADN completamente a la membrana. Para ello colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y colocalo a 80ºC durante 30 minutos.